CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

INTRODUCCIÓN

¿Qué se entiende por curva de calibración?

Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita.
En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente.

PROCEDIMIENTO

Materiales

• Reactivos:

o Solución estándar de albúmina 10 mg/ml

o Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% en NaOH 14%)

• Muestra proteica
• Vaso de precipitado de 100 ml
• Pipeta parcial de vidrio de 2 ml
• Vórtex
• Reloj
• Cubetas para espectrofotómetro
• Gradilla para cubetas
• Micropipeta de 100-1000 ml
• Agua destilada
• Espectrofótometro

Método

• Al comenzar nuestro trabajo debemos recordar la manera de usar las micropipetas, ya que solo unos microlitos de error nos alterarían todo nuestro resultado. Además hay que tener presente que 500 uL es equivalente a 0.5 mL.
• Para obtener nuestras muestras debemos realizar algunas disoluciones, para lo cual utilizaremos la siguiente igualdad, y de esta manera sabremos el volumen de la solución de albúmina que necesitamos ocupar:

o V₁ * C₁ = V₂ * C₂

• Como ya conocemos la cantidad de muestra de albúmina que vamos a ocupar el resto del volumen lo debemos completar con agua destilada. Procedimiento que hay que realizar para cada muestra.

• Tubo 1: agua destilada 0.5ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 2 a y 2 b: Muestra proteica 0.5ml + Reactivo de biuret 2ml
• Tubo 3: Solución estándar 0.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 4: Solución estándar 1.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 5: Solución estándar 2.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 6: Solución estándar 5.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 7: Solución estándar 7.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml
• Tubo 8: Solución estándar 10.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

**El paso más importante en esta etapa es el agregado del reactivo de Biuret que solo se agrega cuando todos los tubos estén con su disolución lista ya que a partir de que se coloca comienza la reacción, y deben comenzar todas las soluciones al mismo tiempo.

• Mezclamos y agitamos los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vórtex
• Dejamos incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos

• Comienza la etapa de la utilización del espectrofotómetro. Para ello tuvimos que elegir 10 cubetas para espectrofotómetro que estuvieran en buen estado, esto es dentro del rango de error permitido de +/- 0,015 absorbancia.
• Después de esto con nuestra muestra blanco lo calibramos a cero para comenzar con nuestro último paso práctico que corresponde a la lectura de la absorbancia.

• Llenamos las 10 cubetas elegidas con las respectivas soluciones de los tubos kahan hasta ¾ de su capacidad total, cuidando de limpiarlas después de haber vaciado el contenido
• Luego introducimos cada cubeta en el espectrofotómetro, anotando los datos de absorbancia de cada muestra
• A partir de estos datos se construyo una curva de calibración

Resultados

Se prepararon seis disoluciones de 500µl, cada una con distinta concentración de BSA, a partir de una solución madre 10mg/ml. Para esto se utilizó la igualdad:

C_inicial . V_inicial = C_final . V_final

Donde

C = Concentración de la solución (mg/ml)

V = Volumen de la solución (µl)

• Ejemplo para calcular el volumen del tubo nº 1 :

Cinicial = 10mg/ml (concentración de la solución madre)

Vinicial = X

Cfinal = 0,5mg/ml (concentración de la solución que se obtendrá después de la dilución)

Vfinal = 500µl (volumen de la solución obtenida)

Luego, reemplazando los valores en (1) tenemos:

10mg/ml . X = 0,5mg/ml . 500µl

Multiplicamos la expresión por 1/10mg/ml

1/10mg/ml . (10mg/ml . X ) = (0,5mg/ml . 500µl) . 1/10mg/ml

Simplificando llegamos a:

X = 0,5mg/ml . 500µl : 10mg/ml  X = 25µl

Si el volumen total de la solución es 500µl, necesitaremos

500µl – 25µl = 475µl de agua destilada para completar la dilución.

Luego, usando el espectrofotómetro, se midió la absorbancia del blanco reactivo, de la muestra problema y de los estándares. Se obtuvieron los siguientes resultados:

Se realizaron dos diluciones iguales a partir de la M.P. nº 5, al medir la absorbancia de cada una de estas soluciones problema, se obtuvo 0,180 y 0,195 lo que promedia 0,188. Éste valor será el utilizado para calcular la concentración de la solución.

Luego, a partir de la tabla nº 2, se realiza el gráfico de la curva:

Gráfico de la curva (realizado en papel milimetrado)

De acuerdo a la ecuación de la recta del Gráfico I, calculamos la concentración de la muestra.

y = Valor de la absorbancia de la solución. = 0,188

x = Concentración de la solución en mg/ml

Luego:

0,188 = 0,0339 ^. x à x₁ = 5,546mg/ml

Bibliografía

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

http://es.scribd.com/doc/18666577/8-Determinacion-de-Proteinas-Sericas

http://es.scribd.com/doc/6695451/Informe-Lab-n1-Espectrofotometria-BSA