DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA - Informe de Laboratorio #10 Bioquímica II

Informe de Laboratorio #10

DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA

MARCO TEÓRICO

Fosfatasa Alcalina 

La Fosfatasa Alcalina (FA) es una enzima que se encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, pero es mayor su presencia en el hígado, las vías biliares y los huesos.

La fosfatasa alcalina tiene un gran variedad de isoenzimas con leves diferencias en su estructura, que sugieren diferentes orígenes por cada tejido (FA1 del hígado, FA2 del hueso). Estas isoenzimas pueden ser cuantificadas por separado si es necesario.

Una de las mayores fuentes de fosfatasa alcalina es el hueso por ello en los niños y adolescentes con crecimiento óseo esta enzima está normalmente elevada.

Se realiza en el contexto de otras pruebas hepáticas (GOT, GPT, Bilirrubina, GammaGT) y se utiliza para evaluar problemas o alteraciones del hígado. Es muy sensible, sobre todo, en problemas de obstrucción de las vías biliares. Es la enzima más sensible a los problemas hepáticos producidos tumores metastásicos.

Suele asociarse a la elevación de la gamaGT, excepto que en los problemas óseos en solo se eleva la fosfatasa alcalina.

FUNDAMENTO

Las fosfatasas alcalinas (FAL)  catalizan la hidrólisis del 4-nitrofenilfosfato (4-NFF) formando 4-nitrofenol y fosfato inorgánico, actuando el tampón alcalino como aceptor del grupo fosfato. 

La reacción se controla cinéticamente a 405 nm a partir de la velocidad de formación del 4-nitrofenol, proporcional a la actividad FAL presente en la muestra.

MATERIALES

• Pipeta automática, de ul

• Muestra (sangre)

• Tubo rojo, para suero sanguíneo

• Espectrofotómetro

• Tubos de ensayo 

• Cubeta de 1cc

• Vacutainer, campana y aguja

• Algodón y alcochol

REACTIVOS

• R1. FAL tampón. Cloruro de magnesio

• R2. FAL sustrato. 4-NFF

PROCEDIMIENTO

1. Tomar la muestra de sangre en tubo rojo

2. Preparar el Reactivo de Trabajo mezclando: 4ml de R1 y 1 ml de R2

3. Preincubar el reactivo de trabajo, muestras y controles a la  temperatura de reacción. 

4. Ajustar a 0 el fotómetro con agua destilada. 

5. Pipetear en una cubeta:

	Desconocido
Reactivo de trabajo	1ml
Muestra	20ul

6. Mezclar suavemente por inversión. 

7. Insertar la cubeta en el  compartimiento a 405nm y poner el cronómetro en marcha. 

8. Incubar durante 1 minuto y anotar la absorbancia inicial.

9. Repetir las lecturas exactamente a los 1,2 y 3 minutos.

10. Calcular la diferencia entre absorbancias.

11. Calcular el promedio de los resultados para obtener el cambio promedio en absorbancia por minuto (ΔA/min).

NORMALIDAD

25ºC 

• Niños, hasta  480 U/L (8,0 µktal/L) 

• Adultos, hasta  180 U/L (3,0 µktal/L) 

30ºC 

• Niños, hasta  590 U/L (9,8 µktal/L) 

• Adultos, hasta  220 U/L (3,7 µktal/L) 

37ºC 

• Niños, hasta  800 U/L (13,3 µktal/L) 

• Adultos, hasta  270 U/L (4,5 µktal/L)

RESULTADOS

• Blanco 0.000
• Muestra (Absorbancia Inicial, 1er min, 2do min y 3er min)
• Factor 2764

      Tiempo Muestra

       Inicial 0,224nm

1er minuto 0,228nm

2do minuto 0,225nm

3er minuto 0,226nm

0,228nm - 0,224nm= 0,004 

0,228nm - 0,225nm= 0,003               

0,226nm - 0,226nm= 0,001                           

0,004 + 0,003 + 0,001 = 0,008 / 3 = 0,0026

0,0026 * 2764 = 7,3706  U/l

CONCLUSIÓN

Para la determinación utilizamos tubo tapa roja para obtener suero sanguíneo debido a que si usamos el de tapa lila que contiene anticoagulante EDTA va a inhibir la actividad enzimática.

Lo que se realizó fue una determinación cinética debido a que medimos la diferencia de reacción enzimática de la muestra al inicio, 1er, 2do y 3er minuto. Además, se la determinó a 405nm y no tuvo color. Para el resultado se calculó la diferencia entre las absorbancias y se las dividió para 3, para obtener el promedio de los minutos. Después se multiplicó para el factor que fue dado 2764.

BIBLIOGRAFÍA

• Fosfatasa Alcalina (s.f.). TuOtroMédico.com. Recuperado de:

 http://www.tuotromedico.com/temas/fosfatasa_alcalina.htm

• ALKALINE PHOSPHATASE BR (s.f.). Linear Chemicals, S.L. Recuperado de: 

http://www.linear.es/ficheros/archivos/8_1103005C.pdf

LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA II

1. DETERMINACIÓN DE GLICEMIA ENZIMÁTICA Y GLUCOSURIA
2. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES Y CUERPOS CETÓNICOS EN LA ORINA
3. DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS
4. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL Y LDL
5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES, ALBÚMINA Y GLOBULINA
6. DETERMINACIÓN DE GPT Y GOT
7. DETERMINACIÓN DE UREA
8. DETERMINACIÓN DE CREATININA
9. DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA Y HEMATÓCRITO
10. DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA